实验材料:

基础培养基(液体或干粉) PET/PETG方形试剂瓶[NEST]

血清(常规为FBS/NBS) 补充剂

移液枪 电动移液枪

15mL、50mL无菌离心管[NEST] 灭菌超纯水

盒装无菌吸头[NEST] 血清移液管[NEST]

超净工作台 双抗(青链霉素混合液)

杯式滤器(0.22μm PES膜) [NEST] 针式滤器 (0.22μm PES膜) [NEST]

实验准备:

血清准备:

配置培养基前一天,将所需血清从-20℃冰库取出,放置入2-8℃冰箱缓慢解冻储存,使用前37℃水浴加热。

培养基准备:

液体基础培养基使用前37℃水浴加热。

实验流程:

基础培养基配置(干粉):

根据配置体积,选择合适的灭菌后容器,在容器中倒入约90%体积的超纯水,将培养基干粉全部倒入该容器中,用少量超纯水将袋内残留粉末洗出。

搅拌30min使所有成分完全溶解,待溶液澄清后,根据说明书加入适当量的碳酸氢钠(分析纯),继续搅拌5-10min至溶解,随后超纯水定容并调节PH值。(过滤会使培养基PH值稍微偏高,所以用1mol/L氢氧化钠溶液或1mol/L盐酸溶液调整PH值至7.20-7.30)

使用0.22μm杯式滤器[NEST]或0.22μm针式滤器[NEST]过滤除菌,并按照日常使用规格分装入PET/PETG方形试剂瓶[NEST]中,2-8℃条件下避光保存备用。【菌检合格后方可使用】

培养基配置:

若含有补充剂,用1000μL无菌吸头[NEST]取出适量预热完成的基础培养基,注入补充剂西林瓶中,将其充分溶解,再将含有补充剂的培养基转移入基础培养基中。

接着按照血清使用比例,用血清移液管[NEST]吸取适量预热完成的血清,注入基础培养基中,盖上瓶盖充分混匀。

双抗加入:

除了特殊筛选系统外,一般正常培养状态下,培养基中不添加任何抗生素。若为防止细菌、真菌污染,或怀疑细胞污染需要清除细菌,可以加入青霉素-链霉素双抗溶液,其培养基中的终浓度为青霉素100U/ml,链霉素为100ug/ml。

培养基保存:

将配置后的完全培养基2-8℃条件下,避光保存备用;或按照使用需求分装入对应规格的PET/PETG方形试剂瓶[NEST]中。隔夜或1-2天后观察完全培养基,溶液澄清通透且无染菌,方可使用。

使用多余的血清,按照剩余量,可分装入15mL/50mL的无菌离心管[NEST]中(防止血清冻存后膨胀泄露问题,离心管工作体积建议为80%),亦可分装入合适规格的PET/PETG方形试剂瓶[NEST]中,并用封口膜封口,-20℃条件下避光保存。

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